本文提要：在国家自然科学基金国家重大科研仪器研制项目支持下，北京大学程和平院士组织跨学科团队，在超高时空分辨微型化在体成像系统研制方面取得突破性技术革新，成功研制可佩戴式高速高分辨双光子荧光显微镜，并在国际上首次获取小鼠自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像。相关研究成果发表在国际权威期刊Nature Method, 并已申请多项专利。此仪器的研制成功改变了在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式，将为实现“分析脑、理解脑、模仿脑”的战略目标发挥不可或缺的重要作用。
目前，世界科技强国纷纷启动有史以来最大规模的脑科学研究计划，人类探索大脑的核心方向之一就是打造用于全景式解析脑连接图谱和功能动态图谱的研究工具。如美国政府和民间脑研究倡议，投入2亿美元发展新的成像手段得到脑活动的动态影像；2013 年，欧盟投入10 亿欧元启动最新旗舰科研项目人类脑研究计划，其中一项重要的任务就是发展非侵入性的成像手段来检测在特定的认知任务下神经元回路的时间和空间响应。如何打破尺度壁垒，整合微观神经元和神经突触活动与大脑整体的活动和个体行为信息，是领域内亟待解决的一个关键问题。
在be365国家重大科研仪器研制项目“超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统”的支持下，北京大学分子医学研究所、信息科学技术学院、动态成像中心、生命科学学院、工学院联合中国人民解放军军事医学科学院组成跨学科研究团队，历经三年多的协同奋战，成功研制“超高时空分辨微型化双光子荧光显微镜”，并在国际上首次获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像。
“超高时空分辨微型化双光子荧光显微镜”体积小，重量仅为2.2克，适于佩戴在小动物头部颅窗上，实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号。此外，在大型动物上，还可望实现多探头佩戴、多颅窗不同脑区的长时程观测。目前已有的成像手段可以实现观察标记的荧光探针随时间变化的特性，推断其反应的生理过程变化。但是，要真正证明基于观察推断的分子机制，还需要对研究对象施加影响并测量其长时程响应。“超高时空分辨微型化双光子荧光显微镜”在脑计划研究中的记录层面改变了观察生物自由活动中的细胞和亚细胞结构的方式。
“超高时空分辨微型化双光子荧光显微镜”应用双光子激发具有良好的光学断层、更深的生物组织穿透能力等优势，实现了横向分辨率0.65μm，从而具有细胞与亚细胞分辨能力的活体三维成像能力，成像质量可媲美商品化大型台式双光子荧光显微镜，远优于目前领域内主导的、美国脑科学计划核心团队所研发的微型化单光子宽场显微镜。为了研究大脑是如何实现学习记忆或对输入感觉信号进行编码的，当代脑功能研究对双光子成像提出了空前高要求--对清醒动物脑中1μm 尺度的突触或树突进行>50Hz 高速实时成像。双光子激光扫描显微镜相比传统的单光子共聚焦显微镜和常规明场显微镜而言，其最明显的优势是它在不透明的生物组织中的穿透深度更深，因此最适合在活体生物组织中进行显微观察。
“超高时空分辨微型化双光子荧光显微镜” 采用双轴对称高速微机电系统转镜扫描和自主研发设计的光子晶体光纤，可实现 920nm 激光传输，成像帧频达40Hz（256*256像素），同时具备多区域随机扫描和每秒1万线的线扫描能力。此前，只能在动物固定的情况下做成像实验，这样不仅限制了动物行为，而且限制了研究领域，动物肢体参与的行为学是无法研究的。荧光信号的接收采用自主研发的柔性光纤束，避免了动物活动时荧光传输光缆拖拽而受到干扰的难题。可以在自由活动的动物上进行研究，在悬尾实验、社交实验、小鼠从高台跳下来等实验过程中，能得到高分辨率和稳定的神经活动图像。在动物觅食、哺乳、跳台、打斗、嬉戏、睡眠等自然行为条件下，或者在学习前、学习中和学习后，可以长时间观察神经突触、神经元、神经网络、远程连接的脑区等多尺度、多层次动态变化。
从微型化、分辨率、成像速度综合来看，“超高时空分辨微型化双光子荧光显微镜”处于国际领先地位。该成果在2016年底美国神经科学年会、2017年5月冷泉港亚洲脑科学专题会议上报告后，得到包括2014年诺贝尔奖得主梅-布莱特·莫泽（May-Britt Moser）教授在内的许多神经生物学家高度评价，认为它拥有核心技术的不可替代性、自主研发的关键器件、高端的设备，具有国际性的竞争能力。冷泉港亚洲脑科学专题会议主席阿尔希诺·J·席尔瓦（Alcino J Silva）教授在评述中写道，“从任何一个标准来看，这款显微镜都代表了一项重大技术发明，它所开启的大门，甚至超越了神经元和树突成像。”
“超高时空分辨微型化双光子荧光显微镜” 将为实现“分析脑、理解脑、模仿脑”的战略目标发挥不可或缺的重要作用，在神经生物学研究中的进一步应用将改变我们在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式，即通过对细胞群体中可辨识的细胞和亚细胞结构的复杂生物学事件进行成像观测，从而更加深刻地理解进化所造就的大脑环路实现复杂行为的核心工程学原理。比如，可望在帕金森症、自闭症等小鼠模型研究行为改变的神经基础上，研究小鼠学习、记忆脑皮层信息处理机制等。同时，“超高时空分辨微型化双光子荧光显微镜”与光遗传学刺激、CFE电化学和电生理融合技术的结合，可望在结构与功能成像的同时，精准地操控神经元和神经回路的活动。